1.表观遗传学概念，分子机制，及表观遗传经典现象

概念： 是指在DNA序列不发生改变的情况下，基因表达发生可遗传变异的现象

分子机制：

  1. DNA甲基化修饰。是表观遗传的主要形式，DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG岛的胞嘧啶五号碳原子上结合一个甲基基团。
  2. 组蛋白修饰：主要组蛋白甲基化和去甲基化、乙酰化与去乙酰化、磷酸化和泛素化。修饰的组蛋白改变了与DNA双链的亲和性，从而改变染色质的疏松或凝集状态，或通过影响转录因子与启动子的亲和性来发挥对基因表达的调控作用。
  3. 组蛋白变体：染色质由许多核小体组成，核小体是由组蛋白H2A，H2B，H3和H4各两个分子构成的八聚体，H1帮助DNA缠绕在核小体上形成高级结构。其中H2A，H3容易产生变体，H2B和H4不容易产生变体。组蛋白H3变体由H3.3、CENP-A、H3.3t，组蛋白H2A变体由H2A.Z、H2A.X、marco H2A、H2A.Bob，组蛋白H2B变体由H2BWT，暂未发现更多的其他变体，组蛋白H4最保守，没有变体。
  4. 非编码 RNA 调控：长链非编码RNA在基因簇乃至整个染色体水平发挥顺式调节作用。短链RNA在基因组水平对极影表达进行调控，可介导mRNA的降解，诱导染色质结构的改变，还对外源的核酸序列有降解作用以保护本身的基因组。常见的短链RNA为SiRNA和miRNA。
  5. 染色质重塑。染色体重塑是指染色体结构和位置的改变。是指在DNA复制或者重组过程中，染色质状态、组蛋白和DNA分子结构发生改变的分子机理。ATP依赖的染色质重塑因子可重新定位核小体，改变核小体结构，共价修饰蛋白。

表观遗传经典现象：

  1. 花斑位置效应（Position-Effect Variegation）:果蝇中，白眼基因正常情况下是红眼表型，它突变之后果蝇变成白眼睛，但有些果蝇的眼睛表型是红白相间的，不是红眼也不是白眼。而染色体会发生连锁互换，当白眼基因改变位置到靠近某个特殊位置周围上时，才会出现红白相间的眼睛表型，白眼基因改变到其他位置时，没有出现红白相间的眼睛的表型。酵母中，观察到另外一种位置效应现象，由ADE2单个基因决定菌落的颜色为白色，如果将ADE2基因敲掉或者失活时，酵母变成红色或者粉色的菌落。但当ADE2基因改变位置到靠近端粒的位置时，酵母菌落变成红白相间的表型。
  2. Polycomb 沉默效应：果蝇中，正常表型是前腿有性梳，后腿没有性梳，但Polycomb突变体的前后腿都有性疏，该突变体是由于Hox基因额错误调控导致的，这就是单个表观遗传因子突变导致形态建成的错误。通过遗传学的筛选可知，有两大类基因和他们编码的蛋白质对Polycomb是重要的。一类是PcG，Ploycomb家族基因，在不该表达Hox基因的地方抑制Hox基因的表达，如果PcG基因被破坏了，Hox基因就会错误表达，此时Polycomb家族基因的作用是抑制基因表达，因此成为Polycomb沉默相应。trxG是三胸基因家族，维持Hox基因的表达。
  3. X染色体失活：磁性哺乳动物只有一条x染色体有活性，另外一条x染色体高度甲基化，浓缩形成异染色质，是去表达活性。
  4. 基因组印记：等位基因在父源染色体和母源染色体上表达情况不同，即一个亲本的等位基因表达，另一个不表达或很少表达。是双亲的等位基因发生不对称修饰导致的。
  5. 植物副突变：在植物中，由于等位基因之间的相互作用，一个等位基因可以使其同源基因发生稳定的可遗传的变化。

二、在真核生物中，基因组DNA会压缩形成复杂的染色质结构，染色质结构及其生物学功能和作用机制？ 染色质结构： 一级结构：核小体串珠结构。核小体是由组蛋白H2A，H2B，H3，H4各两分子组成的八聚体结构。双螺旋DNA缠绕在组蛋白八聚体上，组蛋白H1介导核小体相互连接形成直径约11nm的核小体串珠结构。 二级结构：螺线管结构。核小体串珠结构螺旋盘绕，每6~8个核小体形成30nm螺线管结构。30nm染色质纤维结构是由四聚核小体为结构单元的左手螺旋结构。 三级结构：超螺线管结构。螺线管进一步螺旋化形成直径为0.4μm的圆筒状结构，这种超螺线管结构就是染色体三级结构。 四级结构：超螺线管进一步螺旋折叠，形成长2~10μm的染色单体，即染色质包装的四级结构。

生物学作用：

  1. 染色质是遗传物质的载体。DNA携带了生命个体完整的遗传信息，DNA与组蛋白交联形成核小体，核小体交缠形成染色体，因此染色体是遗传物质的载体。
  2. 染色质是生命信息的调控平台。真核生物的基因组在细胞中以染色质的形式存在，染色质的结构和功能与基因的表达与遗传密切相关。如DNA的复制、转录、重组、突变、修复、非编码RNA的传播、胚胎发育等生理功能都是在染色体平台下完成的。
  3. 染色质是表观遗传的调控平台。是存储表观遗传信息的场所，如组蛋白修饰、染色质重塑等都是在染色体平台上进行的，染色质在基因转录、细胞命运、生殖发育、疾病发生等不同层次调控。

作用机制：染色质通过表观遗传机制，改变染色体三维结构，最终影响基因的表达。组蛋白修饰，如组蛋白甲基化、去甲基化、乙酰化、泛素化修饰等。DNA修饰，如DNA的甲基化、去甲基化、乙酰化、泛素化修饰等。组蛋白变体，染色质重塑因子。

三、简述三维基因研究领域的最新进展 基因组三维结构与功能的研究称为三维基因组学。

  1. 一级结构包括：DNA序列、核小体定位、DNA甲基化。方法：DNA-seq、CHIP-seq、WGBS、RRBS、TAB-seq、ATAC-seq
  2. 二级结构：核小体串珠结构螺旋盘绕、形成30nm螺线管结构。方法：Micro-C，染色质构想捕捉技术、RICC-seq，揭示哺乳动物细胞中30nm染色质结构的zig-zag结构
  3. 高级结构：染色质的空间构想，包括染色体环状结构，染色质-染色质相互作用形成的染色质拓扑结构域，染色质-核结构相互作用形成的染色质区域，染色体在细胞核内定位于疆域。方法：3C、4C、5C、single cell HiC、CHIA-PET、In situ Hi-C、Capture-C

四、哺乳动物与高等植物种DNA甲基化图谱分别如何建立？DNA甲基化的主要生物学作用？

  1. 从头甲基化是指甲基化转移酶的作用下，不依赖已有的甲基化DNA链而在一个新位点将DNA链中的胞嘧啶C5甲基化。
  2. 维持甲基化是指在甲基化DNA半保留复制产生的新生链的相应位置上进行的甲基化修饰，且新生链仅在与亲本链甲基化位置相同的碱基位置发生甲基化。
  3. 植物DNA甲基化修饰主要发生在CpG、CpGpG与CpHpH 三种序列中，高等植物从头甲基化需要DRM2。CG甲基化维持需要MET1，CHG甲基化维持需要CMT3，CHH甲基化维持需要CMT2和DRM2。
  4. 哺乳动物DNA甲基化只发生在CpG岛的胞嘧啶，基本上都是5位的甲基化。甲基化图谱的从头建立：DNMT3A和DNMT3B，DNMT1。甲基化图谱的维持需要DNMT1。

作用：

  1. 转录沉默：DNA甲基化可以作为基因开关，抑制基因转录。可能的机制有两种：
    • DNA本身的甲基化可能在物理上阻碍转录的那白与基因的结合
    • DNA甲基化可以招募组蛋白去甲基化酶和其他染色质重塑因子，从而形成致密的染色质。
  2. 沉默转座原件：DNA甲基化所形成的稳定的染色质环境保证了转座元件的沉默，组织转座原件在基因组上随意跳动，确保了基因组的稳定性。
  3. 维持基因组印记：基因组印记指等位基因在父源染色体上和母源染色体上表达情况不同，基因印记与基因中CpG岛的甲基化密切相关，CpG岛甲基化与否决定基因是否沉默。
  4. X染色体失活：是指雌性哺乳动物细胞中两条X染色体的其中之一失去活性的现象，一条X染色体高度甲基化，浓缩形成异染色质，失去表达活性。

五、主要的DNA 甲基化测序方法

  1. 抗体介导的免疫沉淀方法：哺乳动物中甲基化一般发生在CpG的胞嘧啶5位碳原子上。将基因组DNA超声打断，使用5'甲基胞嘧啶抗体富集高甲基化的DNA片段，对甲基化DNA片段进行测序，而从检测全基因组范围内的甲基化位点。
  2. 甲基化敏感的内切酶介导的方法：甲基化敏感的限制性内切酶无法切割甲基化的位点，使用MSPI酶切基因组DNA，根据大小选择片段，腹肌基因组DNA上富含CCGG位点的片段，然后经过亚硫酸盐处理，然后测序分析。
  3. 基于亚硫酸盐处理的芯片方法：用亚硫酸盐处理的基因组DNA，未甲基化的C会变成U，甲基化的C没有变化。通过芯片杂交，监测甲基化位点
  4. 全基因组亚硫酸盐测序：亚硫酸盐处理基因组DNA，发生甲基化的胞嘧啶不变，而未甲基化的胞嘧啶会变成尿嘧啶，PCR扩增后测序，分析得出甲基化位点。

相对WGBS而言RRBS技术作为高性价比的甲基化测序方案，其测序量大幅减少，在大规模临床样本研究中具有广泛的应用价值。

六、组蛋白贡献修饰的种类

  1. 组蛋白乙酰化和去乙酰化

    • 组蛋白乙酰化是多发生在核心组蛋白N端碱性氨基酸集中区的特定Lys残基上。Lys侧链有氨基，带正电荷，能够与带负电荷的DNA紧密结合。组蛋白乙酰转移酶将乙酰基转移到Lys的氨基上后，Lys上的正电荷被中和，增加了组蛋白与DNA的排斥力，是的染色质结构松散，进而促进基因表达。
    • 去乙酰化是组蛋白去乙酰化酶使组蛋白去乙酰化，与带负电的DNA紧密结合，染色质致密卷曲，基因转录受抑制。
    • 哺乳动物细胞中赖氨酸乙酰化的半衰期有5~8分钟。乙酰化酶没有特异的赖氨酸位点。

  2. 组蛋白甲基化和去甲基化

    • 组蛋白甲基化是由组蛋白甲基化转移酶HMT完成的，可以发生在赖氨酸和精氨酸的残基上。赖氨酸可以分别被单、双、三甲基化，精氨酸只能被单、双甲基化，不同程度的甲基化极大的增加了组蛋白修饰和调节基因表达的复杂性。组蛋白赖氨酸甲基化可以激活和抑制基因转录，这取决于具体的情况，组蛋白精氨酸甲基化是相对动态的标记，与基因激活相关。
    • 组蛋白甲基化转移酶有两类，赖氨酸甲基转移酶和精氨酸甲基转移酶。赖氨酸甲基转移酶根据结构域不同分为SET类型和非SET类型，SET结构域是组蛋白甲基化转移酶的重要结构域，也是大多数转移酶含有的结构域，负责甲基转移酶的酶促活性。精氨酸甲基转移酶根据其酶促活性分为三类，分别是催化精氨酸单甲基化、非对称和对称二甲基化转移酶。
    • 组蛋白去甲基化酶，有赖氨酸特异性去甲基化酶lsd和JMJC家族，他们利用不同的反应机理去甲基。

  3. 组蛋白磷酸化

  4. 组蛋白泛素化